(1)试料和初始悬浮液(首次稀释液)的制备
按重量或体积称取或量取试料,放入灭菌容器或塑料袋中,允许误差为±5%。一定量的试料(至少10g或10mL,或标准方法另有规定)应能代表用于检测的实验室样品。需指出,使用大于最低要求重量或体积的试料可提高定量检测结果的可靠性。
加入9倍于试料重量或体积的稀释液,以制成10倍稀释样液。稀释液最好按质量计量,也可按体积计量,允许误差不得超过±2%。针对某些特定的检测项目,可酌情降低或增加稀释液比率,允许误差亦为±2%。为避免因温度的骤然变化而损伤目标微牛物,除非对特定产品的特殊规定,所有稀释液的温度应与实验室室温大致相同、按标准要求均质样品和稀释液的混合物,如有必要,可静止不超过15min,以让大颗粒物质沉淀,或采用滤过系统去除此类物质,例如使用带滤膜的塑料样品袋。
某些种类的产品若按1∶10稀释制备可能形成较为黏稠或浓厚的悬浮液,影响后续操作,这些情况下可按1:20、1:50及1:100等稀释比率添加稀释液，直至形成适用于后续试验的悬浮液。这些非标准化的稀释比率应换算到后续操作中,尤其是进行计算和结果表述时。另一些情况下,当检测样品中较低数量的微生物,且受试样品可制成适宜的初悬液时，可能需要制备1:2或1 :5等较低的稀释比率。然而需注意的是,使用低稀释比率的初始悬浮液,在后续转种至液体培养基或固体培养基时可能造成样品基质与培养基比例的不平衡(如食品组分浓度的相应增高会抑制目标微生物的生长),因此低稀释液比率需谨慎使用,并需按具体的案例逐个进行验证。
进行芽孢计数时,应在初始悬浮液制备后立即进行热处理,如在80℃±5℃,维持10min±1min,然后迅速使用流动冷水浴等冷却悬浮液,以尽量减少对目标微生物芽孢的损耗。
(2）操作持续时间
从初始悬浮液制备完成到整体接种操作完成,其间不得超过45min。从制备悬浮液到制备后续稀释液间不得超过30min。若实验室环境温度偏高,超过了建议范围(>27℃),则稀释操作的持续时间应相应缩减,尽量避免可能因微生物的增殖导致计数检测结果偏高。
某些标准方法中要求稀释时有一个复苏期,以尽量修复受损伤的微生物,此复苏期应从初始悬浮液制备完成开始计算,结束后应立即开展后续稀释步骤。
(3）常用稀释液的相关要求
为提高微生物检测结果的再现性,建议使用商品化的即用稀释液或干粉培养基,并严格按使用说明进行配制和使用。培养基的化学成分应为分析纯并适用于微生物检测?配制用水应符合要求。各种稀释液应符合再现性要求,标准为添加一定数量的指定微生物(如大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌),在实验室环境温度(18℃~27℃)下培养45min~1h后,菌落计数结果应不超过初始计数结果的±30%。
用于计数检测的初始悬浮液,经分装灭菌后的最终液量与标准规定的允许误差不得超过士2%。为确保达到此允许误差,宜将大体积的稀释液灭菌后再精确地无菌分装。
ISO 6887-1中规定的通用稀释液有以下几种:
① 蛋白胨盐溶液(酶消化酪蛋白1.0g,NaCl 8.5g,水1000mL。在水中溶解各组分,分装,灭菌,pH7.0±0.2);
② 缓冲蛋白胨水(蛋白胨10.0g,NaCl 5.0g,Na2HPO4·12H2O 9.0g,KH2PO41.5g，水1000mL。在水中溶解各组分,分装,灭菌,pH7.0±0.2);
③ 双料缓冲蛋白胨水,用于高酸性产品(将双份缓冲蛋白胨水的成分溶解于1000mL水中,分装,灭菌,pH7.0±0.2)。
GB 4789《食品安全国家标准食品微生物学检验》系列标准中规定的稀释液为以下两种:
① 生理盐水(称取8.5g NaCl溶于1000mL蒸馏水中,121℃高压灭菌15min);
② 磷酸盐缓冲液(贮存液:称取34.0g的KH2PO4溶于500mL蒸馏水中,用大约175mL的1mol/L氢氧化钠溶液调节pH至7.2,用蒸馏水稀释至1000mL后贮存于冰箱。稀释液:取贮存液1.25mL,用蒸馏水稀释至1000ml,分装于适宜容器中,121℃高压灭菌15min)。
霉菌和酵母计数检验中规定除生理盐水和磷酸缓冲液,也可使用无菌水作为样品稀释液。
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