“三区划线法”是实验室最常用的平板划线接种方法，通过在平板上划线，将细菌在琼脂平板表面充分地分散开，使单个细菌能固定在一点上繁殖，形成单个菌落，以达到分离纯化地目的，常常分三个区域进行划线，故称为“三区划线法”。
“三区划线法”的操作：第一区起始位置可反复划线，然后之字形划线，划线区域不超过平板1/3；第二区，平板旋转60度，之字形划线，最初的几条线与第一区的右侧末端交叉且之字划线，之后连续划线不再与一区接触；第三区，平板再旋转60度，进行三区划线，规则与第二区划线相同。各区首尾相接，菌量逐步减少，达到形成单个菌落的目的。
为什么划不出单菌落？常见原因如下：
1.没有充分利于好划线区域；
2.各区域线过于密集，线与线之间重叠；
3.与前一区交叉过多；
4.划线时接种环接触点变动，未始终保持接种环的一点接触琼脂表面；
5.未掌握好划线力度与角度，划破琼脂；
6.待接种的细菌菌量过多时，可在第一区划线完成后进行灼烧，再进行第二、三区的划线。
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